LipiDye^®-M ＜Lipid Metabolism Tracer＞

用于脂肪酸代謝過(guò)程的多色活細(xì)胞成像試劑

LipiDye^®-M是一種由環(huán)境響應(yīng)熒光染料標(biāo)記的熒光標(biāo)記脂肪酸。LipiDye^®-M的熒光顏色會(huì)根據(jù)脂質(zhì)的代謝狀態(tài)及其周圍環(huán)境的不同發(fā)生明顯的變化，因此可以通過(guò)綠色、黃色和紅色熒光反應(yīng)觀察到脂肪酸的代謝過(guò)程。本產(chǎn)品可用于脂質(zhì)代謝相關(guān)的基礎(chǔ)研究和以脂質(zhì)代謝為靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)研究。

※本產(chǎn)品是以名古屋大學(xué)transformative生物分子研究所 山口茂弘教授和多喜正泰特任副教授 的研究成果為基礎(chǔ)，由Funakoshi株式會(huì)社進(jìn)行商品化并銷售。

※本產(chǎn)品僅供研究，研究以外不可使用。

LipiDye^®-M細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程圖（左）和染色示例（右）

LipiDye^®-M是一種環(huán)境響應(yīng)性染料標(biāo)記脂肪酸，它的特性是通過(guò)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)參與脂質(zhì)代謝過(guò)程時(shí)，熒光會(huì)隨著每次局部反應(yīng)變化而發(fā)生變化。通過(guò)成像獲取綠色熒光和紅色熒光圖像并將兩者疊加，可以觀察到與脂質(zhì)代謝狀態(tài)相關(guān)的三種不同顏色的結(jié)果。

◆脂肪酸代謝與LipiDye^®-M

脂肪酸是脂質(zhì)的最小單位，在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化為各種脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，如酰基fumeiA、磷脂、糖脂、甘油二酯(DAG)和甘油三酯(TAG)等。脂肪酸代謝受到多種酶的嚴(yán)格調(diào)控，因此酶和調(diào)控機(jī)制的改變也被認(rèn)為與脂質(zhì)代謝類疾病有關(guān)。為充分探究脂質(zhì)的代謝過(guò)程，熒光標(biāo)記脂肪酸作為分析脂肪酸代謝過(guò)程的工具被廣泛使用，但由于其顏色不隨脂肪酸代謝的過(guò)程而改變，因此難以區(qū)分各個(gè)代謝階段并逐一進(jìn)行分析。

LipiDye^®-M（論文原名：AP-C12）是一種能夠克服上述問(wèn)題的新型熒光標(biāo)記脂肪酸。由名古屋大學(xué)transformative生物分子研究所 山口茂弘教授和多喜正泰特任副教授研究開(kāi)發(fā)，使用C12脂肪酸為載體，連接新型熒光色素Azapyrene，含熒光基團(tuán)在內(nèi)總長(zhǎng)相當(dāng)于C18脂肪酸（圖1左）。Azapyrene不同于常規(guī)使用的熒光染料，能夠識(shí)別周圍分子的極性使吸收波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)同時(shí)發(fā)生變化。Azapyrene具有在強(qiáng)極性環(huán)境（親水性）中轉(zhuǎn)變?yōu)?span style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(0, 176, 80);">綠色，在弱極性環(huán)境（疏水性）中轉(zhuǎn)變?yōu)?span style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(255, 0, 0);">紅色的特性。因此通過(guò)選擇適宜的激發(fā)光源和檢測(cè)波段，可以區(qū)分和觀察各種環(huán)境中的脂質(zhì)代謝狀態(tài)。

根據(jù)上述性質(zhì)，LipiDye^®-M通過(guò)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)參與脂質(zhì)代謝過(guò)程，轉(zhuǎn)化為各種脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。在其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的不同位置后，即如圖2所示，熒光顏色會(huì)根據(jù)細(xì)胞器膜極性發(fā)生變化。通過(guò)熒光顯微鏡觀察使用LipiDye^®-M處理后的活細(xì)胞，得到綠色熒光圖（激發(fā)：450-490 nm，推薦：473 nm；發(fā)射：490-540 nm）和紅色熒光圖（激發(fā)：540-600 nm，推薦：559 nm；發(fā)射：570-620 nm），將兩者重疊后即可獲得如圖3所示的三色可視化脂質(zhì)代謝狀態(tài)圖。在重疊后的圖像中，細(xì)胞質(zhì)（游離脂肪酸，?；疌oA）及線粒體腔（β脂肪酸氧化代謝產(chǎn)物）顯示為綠色，各種細(xì)胞器膜（磷脂，DAG等）顯示為黃色，脂滴（TAG）顯示為紅色。對(duì)綠色熒光圖與紅色熒光圖進(jìn)行各種比率分析，可進(jìn)行進(jìn)一步的定量解析。若想了解根據(jù)比率解析進(jìn)行定量解析的方法，請(qǐng)參考原著論文^[1]。

圖2：LipiDye^®-M代謝過(guò)程與熒光變化過(guò)程圖

◆特點(diǎn)

● 根據(jù)脂肪酸代謝和細(xì)胞器環(huán)境的不同，熒光顏色呈綠色~紅色變化。

● 可根據(jù)熒光圖追蹤脂肪酸代謝過(guò)程。

● 作為游離脂肪酸的LipiDye^®-M通過(guò)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化為?；鵩umei A、甘油二酯（DAG）、甘油三酯（TAG）、磷脂及

   β脂肪酸氧化產(chǎn)物。

● 熒光在強(qiáng)極性環(huán)境（細(xì)胞質(zhì)）下呈綠色、中極性環(huán)境（細(xì)胞膜）下呈黃色、弱極性環(huán)境（脂滴）下呈紅色。

● 綠色熒光圖（激發(fā)：450-490 nm，推薦：473 nm；發(fā)射：490-540 nm）和紅色熒光圖（激發(fā)：540-600 nm，推薦：559 nm；發(fā)射：570-

   620 nm），將兩者重疊后可獲得三色可視化脂質(zhì)代謝狀態(tài)圖。通過(guò)所得的綠色/紅色熒光比率，可進(jìn)行定量比率分析。

熒光波長(zhǎng)（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)）

為了準(zhǔn)確觀察LipiDye^®-M的環(huán)境響應(yīng)性差異，需要確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)。推薦使用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)時(shí)可參考下表范圍。

LipiDye^®-M在PBS、磷脂脂質(zhì)體和大豆油中的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

◆應(yīng)用實(shí)例

脂肪細(xì)胞染色例

向脂肪細(xì)胞（由3T3-L1細(xì)胞分化）中添加LipiDye^®-M（5μM），添加后無(wú)需清洗，分別在1分鐘后和30分鐘后，使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察熒光（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）。添加1分鐘后，從細(xì)胞質(zhì)中觀察到較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)。同時(shí)觀察到脂滴的紅色熒光信號(hào)較弱，因此可推測(cè)LipiDye^®-M主要以游離脂肪酸或脂肪酸CoA狀態(tài)存在于細(xì)胞中，尚未被脂滴充分?jǐn)z入。添加30分鐘后，綠色熒光信號(hào)減弱，脂滴的紅色熒光信號(hào)增強(qiáng)，LipiDye^®-M轉(zhuǎn)變?yōu)門AG，由此可推測(cè)脂滴已充分?jǐn)z入LipiDye^®-M。使用TAG合成酶（DGAT）抑制劑進(jìn)行處理，30分鐘后，能觀察到脂滴的紅色熒光信號(hào)明顯被抑制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）等細(xì)胞器膜呈現(xiàn)的黃色熒光信號(hào)增強(qiáng)。這一結(jié)果表明，LipiDye^®-M在轉(zhuǎn)化為DAG后并未繼續(xù)轉(zhuǎn)化為TAG，而是滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膜上。

HepG2細(xì)胞染色例

在含有油酸和棕櫚酸的10% FBS條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，以促進(jìn)脂滴產(chǎn)生。使用HBSS替換培養(yǎng)基，在饑餓狀態(tài)下使用LipiDye^®-M（5μM）處理60分鐘后，于未洗滌條件下使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559 nm / Em 570～620 nm）。細(xì)胞饑餓狀態(tài)下可觀察到LipiDye^®-M分布于HepG2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（綠色），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（黃色），脂滴（紅色）及線粒體（黃色）中。為確認(rèn)LipiDye^®-M的代謝狀態(tài)，抽取HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)成分并使用TLC分離后，以LipiDye^®-M的熒光為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。觀察到TLC板上的多點(diǎn)表明，LipiDye^®-M在HepG2細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為各種脂質(zhì)，TAG或膽guchun酯分布在游離脂肪酸型LipiDye^®-M的上方（高疏水性），細(xì)胞器中的β脂肪酸氧化（FAO）代謝產(chǎn)物和DAG分布在下方（低疏水性），磷脂則被認(rèn)為分布在原點(diǎn)附近。

為確認(rèn)LipiDye^®-M的代謝狀態(tài)，抽取HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)成分并使用TLC分離后，以LipiDye^®-M的熒光為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。觀察到TLC板上的多點(diǎn)表明，LipiDye^®-M在HepG2細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為各種脂質(zhì)，TAG或膽guchun酯分布在游離脂肪酸型LipiDye^®-M的上方（高疏水性），細(xì)胞器中的β脂肪酸氧化（FAO）代謝產(chǎn)物和DAG分布在下方（低疏水性），磷脂則被認(rèn)為分布在原點(diǎn)附近。

藥物處理引起的脂質(zhì)代謝變化

在含有CoA合成酶（ACS）抑制劑（Triacsin C）或TAG合成酶DGAT1抑制劑 （T863）的培養(yǎng)基中，對(duì)HepG2 細(xì)胞進(jìn)行18小時(shí)的預(yù)處理，以抑制細(xì)胞內(nèi)代謝途徑（右圖）。之后，為了促進(jìn)脂滴的產(chǎn)生，在饑餓條件下用含有油酸 (0.5 mM)、抑制劑和 LipiDye^®-M（5 μM）的HBSS培養(yǎng)基處理細(xì)胞6小時(shí)。在未洗滌的條件下使用共聚焦激光掃描顯微鏡（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559nm / Em 570～620 nm）進(jìn)行觀察。與對(duì)照組中脂滴的強(qiáng)紅色熒光相比，經(jīng)ACS抑制劑處理后的細(xì)胞中脂滴的紅色熒光和細(xì)胞器膜的黃色熒光變?nèi)?，觀察到綠色熒光較強(qiáng)。而另一組經(jīng)DGAT1抑制劑處理后的細(xì)胞中，脂滴的紅色熒光幾乎無(wú)法用肉眼識(shí)別，細(xì)胞器膜的黃色熒光顯著增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)ACS抑制劑處理過(guò)后的細(xì)胞由于無(wú)法將含LipiDye^®-M的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成?；鵆oA，因此仍然以游離脂肪酸的形態(tài)存在于細(xì)胞中。另外也確認(rèn)到了DAG由于DGAT1抑制劑的影響無(wú)法轉(zhuǎn)化成TAG，使其無(wú)法轉(zhuǎn)移至脂滴并積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其他細(xì)胞器膜上。如上述實(shí)例所示，在使用藥物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，可通過(guò)對(duì)LipiDye^®-M進(jìn)行局部熒光分析，了解藥物參與脂質(zhì)代謝的哪一過(guò)程。

脂質(zhì)分解途徑抑制劑的作用

在含有自噬抑制劑（50 nM Bafilomycin A1；自噬體-溶酶體膜融合抑制劑）或脂肪分解抑制劑（100 μM DEUP）的HBSS培養(yǎng)基和LipiDye^®-M（5 μM）的HBSS中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞6小時(shí)后，使用共聚焦激光掃描顯微鏡（Green channel Ex 473 nm / Em 490～540 nm，Red channel Ex 559nm / Em 570～620 nm）進(jìn)行觀察，得到重疊后的熒光圖像和比率分析圖。在重疊后的對(duì)照組熒光圖像中，囊泡樣結(jié)構(gòu)（自噬體）的膜呈黃色，因此可推斷由自噬引起的脂質(zhì)分解受到了抑制。另外，在使用脂肪分解抑制劑培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的組中，觀察到重疊熒光圖像中整體的紅色熒光增強(qiáng)，由此可見(jiàn)LipiDye^®-M多積累于脂滴中和細(xì)胞器膜上。

通過(guò)比率分析圖和分布圖可得知，相比于對(duì)照組和自噬抑制劑處理后的細(xì)胞，使用脂肪分解抑制劑處理的細(xì)胞其熒光Green/Red的比率大幅減少。

※具體的比率解析方法請(qǐng)參考原著論文。