高存活率細(xì)胞凍存液

CryoScarless^® DMSO-Free

CryoScarless^® DMSO-Free 是一款不含蛋白和 DMSO，適用于多種細(xì)胞的細(xì)胞凍存液。各種細(xì)胞在解凍后具有很高的培養(yǎng)活率，且維持了干細(xì)胞的多分化性（未分化狀態(tài)）。

◆關(guān)于含有DMSO凍存液的問題

DMSO作為普通細(xì)胞冷凍保護(hù)成分常被添加到凍存液中，但同時(shí)也是對(duì)人體有害的成分，且極易被皮膚吸收。除具有細(xì)胞毒性外，如同下列論文所述，是影響細(xì)胞分化的因子之一。因此，為獲得更精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無DMSO的細(xì)胞保存是必須的。

● 使用DMSO將人骨髓白血病細(xì)胞株 HL-60 分化為粒細(xì)胞。¹

● 使用DMSO將小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。 ²

● 使用含有DMSD的凍存液凍存人ES細(xì)胞發(fā)現(xiàn)未分化標(biāo)記Oct-4的表達(dá)降低。 ³

參考文獻(xiàn)

1. Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

2. Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

3. Katkov, I. I., et al., Cryobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆特點(diǎn)

● 不含血清和蛋白，因此不受白蛋白和球蛋白等蛋白的影響。

● 不受DMSO毒性和蛋白影響，可安全且高活率地凍存細(xì)胞。

● 大部分細(xì)胞在凍存后復(fù)蘇，存活率可達(dá)90%以上。

● 已有人/小鼠的正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、干細(xì)胞等各種細(xì)胞的凍存應(yīng)用。

● 凍存后可維持干細(xì)胞的分化性能。

● 同樣適用于無血清培養(yǎng)。

● 經(jīng)無菌測(cè)試確認(rèn)不含細(xì)菌、真菌與支原體污染。

● 本產(chǎn)品可在４°C下長(zhǎng)期保存。（有效期２年）。 

※　使用臺(tái)盼藍(lán)處理CryoScarless保存的細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)務(wù)必清洗細(xì)胞。

◆應(yīng)用實(shí)例１

大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力

確認(rèn)使用本產(chǎn)品凍存的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在復(fù)蘇后的分化能力，并與未凍存組以及10% DMSO保存的細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，使用本產(chǎn)品凍存的細(xì)胞皆維持良好的分化性能。

大鼠間充干細(xì)胞的存活率

檢測(cè)使用本產(chǎn)品凍存（１周）的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在復(fù)蘇后的存活率以及 6 h后的存活率，并與10% DMSO保存的情況進(jìn)行比較。本產(chǎn)品無論是在剛復(fù)蘇（0 h），還是貼壁后（6 h）皆顯示更高的存活率。

◆應(yīng)用實(shí)例2

使用 CryoScarless^® DMSO-Free 簡(jiǎn)單凍存后的小鼠 ES 細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方法：

將小鼠 ES 細(xì)胞（FKHR＋/＋）在明膠包被的96孔板上于37°C培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行簡(jiǎn)單地凍存。吸走培養(yǎng)基并用PBS清洗，然后分別添加10%DMSO/培養(yǎng)基，或CryoScarless^® DMSO-Free，在-80°C下保存。24 h后迅速?gòu)?fù)蘇，添加加熱至37°C的培養(yǎng)基，在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后使用光學(xué)顯微鏡觀察相襯圖像。

結(jié)果：

可觀察到在10%DMSO/培養(yǎng)基中保存的小鼠ES細(xì)胞在復(fù)蘇后活細(xì)胞減少（左圖），而在 CryoScarless^® DMSO-Free 中保存的小鼠ES細(xì)胞狀態(tài)得到改善，可觀察到大部分的活細(xì)胞。

討論：

在對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)基因克隆的培養(yǎng)板一起進(jìn)行凍存時(shí)（簡(jiǎn)易凍存），使用CryoScarless^® DMSO-Free 更加方便。利用 CryoScarless^® DMSO-Free 進(jìn)行凍存，存活細(xì)胞更多，更易于未分化小鼠ES細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（在一定細(xì)胞密度下每２天傳代一次），并可順利進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)。

數(shù)據(jù)提供

熊本大學(xué)發(fā)育醫(yī)學(xué)研究所 干細(xì)胞部門 組織干細(xì)胞領(lǐng)域 田村潔美老師

小川峰太郎老師（組織干細(xì)胞領(lǐng)域教授：中間），田村潔美老師（右起2）與研究室成員

◆應(yīng)用實(shí)例３

對(duì)于人牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，CryoScarless^® DMSO-Free 擁有更出色的凍存能力

日本牙科大學(xué)生命牙學(xué)部 發(fā)育、再生醫(yī)科講座 中原貴教授

生命牙科學(xué)講座 望月 真衣 助教

Establishment of xenogeneic serum-free culture methods for handling human dental pulp stem cells using clinically oriented in-vitro and in-vivo conditions.

Stem Cell Research & Therapy,, 9：25, (2015).

背景

由于再生醫(yī)學(xué)不斷普及，因此急需確立可安全地培養(yǎng)從患者獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。近年來，通過牙科治療從拔牙的牙組織（牙髓）中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，顯示比骨髓干細(xì)胞高3~4倍的高增殖性，且沒有伴隨染色體異常的細(xì)胞變化。而且牙髓干細(xì)胞擁有與骨髓干細(xì)胞相同的多分化性能。由于在體外培養(yǎng)可大量增殖，靈活利用低癌變和成瘤風(fēng)險(xiǎn)的牙髓干細(xì)胞，對(duì)于確保醫(yī)療安全性的再生醫(yī)學(xué)來說是一個(gè)ji具吸引力的選擇。

作為再生醫(yī)學(xué)中bi不可少的"細(xì)胞凍存"，已經(jīng)證明CryoScarless^® DMSO-Free（BioVerde公司）是一款優(yōu)秀的細(xì)胞凍存液。換言之，使用該細(xì)胞凍存液凍存的人牙髓干細(xì)胞擁有與未經(jīng)凍存培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞相同的增殖能與多分化能力，且未發(fā)現(xiàn)染色體異常。

本文著眼于牙髓干細(xì)胞活躍的增殖能力，并證實(shí)了CryoScarless^® DMSO-Free不會(huì)影響細(xì)胞增殖能力。

方法及結(jié)果

從20~37歲成人拔下來的智齒分離牙髓細(xì)胞并進(jìn)行無血清培養(yǎng)，培養(yǎng)至傳代數(shù)為1時(shí)使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存。3個(gè)月后再次培養(yǎng)凍存的細(xì)胞，傳代數(shù)到3時(shí)進(jìn)行以下的細(xì)胞評(píng)價(jià)。同時(shí)，對(duì)未經(jīng)凍存的牙髓細(xì)胞也進(jìn)行了相同的評(píng)價(jià)。

使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)紡錘形的成纖維細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生變化（圖-1）。根據(jù)增殖曲線分析的結(jié)果，經(jīng)過12天的培養(yǎng)，呈現(xiàn)一致的細(xì)胞增殖模式，兩者間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的沒有顯著差異（圖-2）。另外，通過Bromodeoxyuridine（BrdU）進(jìn)行細(xì)胞分裂能力分析的結(jié)果顯示，可觀察到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)大量的BrdU陽性細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異（圖-3）。

圖-1 人牙髓干細(xì)胞的相差顯微鏡圖像

無論CryoScarless^® DMSO-Free凍存（左）還是未經(jīng)凍存（右）的細(xì)胞都呈現(xiàn)出相同的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。

圖-2 人牙髓干細(xì)胞增殖曲線分析

細(xì)胞培養(yǎng)期間，未發(fā)現(xiàn)兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。

圖-3 人牙髓干細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的BrdU分析

可觀察到大部分細(xì)胞攝入BraU（綠）（左），未發(fā)現(xiàn)兩者的BraU陽性細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（右）。

結(jié)論

除了本文中報(bào)告的細(xì)胞增殖能力評(píng)價(jià)之外，使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存的牙髓干細(xì)胞不僅維持了成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的多分化能力，也能維持向免疫缺陷小鼠的皮下移植并引起硬組織形成的能力。并且該產(chǎn)品并不影響干細(xì)胞的特性。

另外，值得注意的是，使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存的牙髓干細(xì)胞即使長(zhǎng)期培養(yǎng)至傳代數(shù)為10后仍然保持染色體的二倍體和正常核型，大量培養(yǎng)的細(xì)胞中也沒有發(fā)現(xiàn)染色體異常。

在再生醫(yī)學(xué)中bi不可少的"細(xì)胞凍存"中，作為冷凍保護(hù)劑使用的Dimethyl sulfoxide（DMSO）可能會(huì)有細(xì)胞毒性和引起意外的細(xì)胞分化，因此，我們十分期待能夠確立一個(gè)像該產(chǎn)品一樣的無DMSO的細(xì)胞凍存體系。

本報(bào)道中使用易于獲得的牙髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞，研究了CryoScarless^® DMSO-Free對(duì)干細(xì)胞特性的影響，并確認(rèn)了使用該產(chǎn)品凍存的細(xì)胞與未經(jīng)凍存的牙髓干細(xì)胞擁有相同的細(xì)胞特性。因此，CryoScarless^® DMSO-Free在間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)研究以及臨床前研究，甚至是將來的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，有望成為一款可以提供安全且高預(yù)測(cè)性數(shù)據(jù)和治療成果的細(xì)胞凍存液。

中原貴教授（前排右），望月真衣助教（前排左）與研究室成員

◆實(shí)際應(yīng)用的細(xì)胞和凍存效果

* -80°C凍存3個(gè)月，復(fù)蘇后24 h

◆操作方法概要

1. 將培養(yǎng)細(xì)胞放入離心管，離心并去掉上清。

2. 按照5×10⁵～5×10⁶ cells/mL添加本產(chǎn)品，并制成細(xì)胞懸液，每個(gè)凍存管分裝1 mL。

3. 放入－80℃超低溫冰箱中凍存。

4. 將在上一步中保存的細(xì)胞放入37°C恒溫水浴槽中，快速晃動(dòng)使細(xì)胞解凍，融化后放入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基（10 mL）中并離心清洗。

※長(zhǎng)期保存請(qǐng)置于液氮罐中保存。